大家好,小问来为大家解答以上问题。蓝白斑筛选原理及步骤，蓝白斑筛选原理这个很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧！

1、载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。

2、在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。

3、不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。

4、载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。

5、在载体pGEMZ的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。

6、α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。

7、重组质粒转化到合适的菌株中（JM109， DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。

8、可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。

9、IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。

10、IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月　　重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。

11、利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。

12、现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。

13、Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。

14、宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。

15、Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。

16、由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。

17、因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。

18、而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

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